Эксклюзионная (size-exclusion – исключение по размерам), или ситовая (молекулярно-ситовая), или гель-хроматография – особый вид жидкостной хроматографии, основанный на различии между размерами частиц разделяемых компонентов и пор неподвижной фазы. Аналиты распределяются между растворителем внутри пор сорбента и растворителем, протекающим между его частицами. Сорбенты играют роль молекулярных сит. Они проницаемы только для частиц определенного размера.
Таким образом, неподвижной фазой является тот же растворитель, заполнивший поры, а роль твердого наполнителя состоит лишь в формировании пор определенного размера, т.е. понятие «сорбент» в эксклюзионной хроматографии весьма условно.
Употребляемые термины – гель-фильтрационная и гель-проникающая хроматография – отражают характер используемых элюентов. В первом случае – это водные растворители, во втором – органические (тетрагидрофуран, дихлорметан, толуол). В гель-фильтрационной хроматографии проводят разделение водорастворимых веществ на гидрофильных сорбентах. Выбор подвижной фазы определяется ее способностью растворять образец.
Фактор, контролирующий удерживание – размер пор геля. Поскольку элюент не взаимодействует с образцом, он не влияет на удерживание. Удерживание может быть повышено при использовании геля с более высоким пределом эксклюзии (больший размер пор) и понижено при использовании – более низкого предела экскдюзии (меньший размер пор).
Принципиальные особенности метода:
– Продолжительность анализа в конкретно используемой системе известна заранее.
– Порядок элюирования предсказуем: первыми из колонки элюируются молекулы с большей молекулярной массой, последними – с меньшей.
– Ширина пиков независимо от времени элюирования одинакова.
– И, наконец, компоненты элюируются без потерь, поскольку в этом виде хроматографии отсутствуют какие-либо взаимодействия сорбента с аналитом.
Классификация гелей:
Используемые в гель-хроматографии сорбенты (гели) могут быть классифицированы по различным признакам:
В зависимости от природы материала геля: неорганические (пористые силикагели, стекла) и органические (поливинилацетаты, полистирол, алкилированные сшитые декстраны
а) По совместимости с водными или неводными элюентами: гидрофильные (декстраны, сшитые эпихлоргидрином – сефадексы; сополимеры акриламида и бисакриламида – биогель Р; агарозные гели – сефарозы) и органофильные (сополимеры стирола и дивинилбензола – порагель, меркогель). Гидрофильные гели используют для разделения полисахаридов, белков и совместимы с водными элюентами.
б) По жесткости матрицы: мягкие, полужесткие и жесткие. Последние имеют фиксированный размер пор и высокую механическую прочность и используются в ВЭЖХ.
в) По способности к набуханию: ксерогели (набухающие) и аэрогели (ненабухающие)
.
г) По способу приготовления их можно подразделить на гомогенные, полугетерогенные и гетерогенные. Гомогенные готовят сшиванием линейных полимеров. Плотность матрицы этих гелей зависит от молекулярной массы исходного линейного полимера. Гомогенные гели прозрачны, набухают в растворителях. Степень набухания обратно пропорциональна плотности матрицы. Плотность матрицы определяет рабочий диапазон геля. С уменьшением плотности увеличивается эксклюзионный предел геля, уменьшается механическая прочность частиц.
Гетерогенные гели готовят сополимеризацией, ранние стадии которой сопровождаются осаждением полимера; полугетерогенные образуются в процессе суспензионной сополимеризацией в присутствии растворителя.
Для ВЭЖХ в качестве сорбентов используют пористые стекла, частицы силикагеля или полимеры. Размер частиц сорбента 5 – 10 мкм. Использование пористых стекол и силикагеля характеризуется быстрым установлением равновесия. Однако они проявляют адсорбционную активность, и поверхность таких сорбентов предварительно обычно дезактивируют силанизацией.
