Дегазация
Перед началом работы подготовленную подвижную фазу необходимо дегазировать – освободить от растворенных пузырьков воздуха, которые нарушают работу детектора, вызывают дрейф нулевой линии, снижают разрешение компонентов. Дегазацию осуществляют одним из следующих способов: продувкой током гелия, перемешиванием с использованием вакуума водоструйного насоса или ультразвуковым перемешиванием. Дегазация гелием основана на низкой растворимости этого газа в жидкостях. При барботировании через слой растворителя продувочный газ захватывает и уносит из системы растворенный воздух. Этот способ особенно предпочтителен при использовании легко окисляющихся растворителей.
Очистка растворителя.
Растворители должны быть тщательно очищены и освобождены от взвешенных частиц. Простейший способ очистки – пропускание его через мембранный фильтр с размером пор 0,5 мкм под вакуумом. Следует избегать использования растворителей, кипящих ниже 500 С, поскольку это может вызвать резкие перепады давлений, появление пузырьков. Требования к чистоте растворителя, в первую очередь, определяются выбранным детектором. Незначительная примесь непредельных углеводородов в алканах практически не сказывается на работе рефрактометрического детектора, но не позволяет использовать УФ-детектор с поглощением на длине волны 260 нм. При этом добавка гептана к гексану не влияет на работу УФ-детектора. Элюенты, представляющие собой алканы, очищают от непредельных углеводородов, концентрированной серной кислотой с последующим промыванием дистиллированной водой до нейтральной реакции и осушкой. Высушенные растворители затем подвергают перегонке. Алкены можно также удалить колоночной хроматографией на силикагеле, пропитанным раствором нитрата серебра. Хлорсодержащие элюенты част имеют в качестве примеси HCl. Образующийся при их хранении. Под действием НСl могут подвергаться коррозии металлические детали и разрушаться адсорбенты. Удаляют НСl адсорбционной очисткой на щелочном оксиде алюминия. При очистке метанола наиболее трудно отделяемой примесью является ацетон, который удаляют обработкой гипойодитом натрия. При проведении хроматографического анализа в режиме адсорбционной хроматографии необходима тщательная осушка растворителя, т.к. наличие влаги в элюенте заметно изменяет факторы удерживания разделяемых компонентов. При градиентном элюировании требования к чистоте растворителей сильно возрастают, поскольку примеси в элюенте могут концентрироваться на начальном участке колонки и при увеличении полярности подвижной фазы элюироваться, что является причиной появления на хроматограмме ложных пиков.
Выбор метода жидкостной хроматографии
При выборе условий разделения (природы подвижной и неподвижной фаз) необходимо учитывать молекулярную массу разделяемых компонентов, полярность, природу сопутствующих соединений, от которых необходимо отделить исследуемое вещество. Если молекулярная масса определяемого вещества превышает 2000 у.е., то метод анализа, к которому следует обратиться – эксклюзионная хроматография. Для разделения ионогенных соединений целесообразно применение ионообменной хроматографии. В остальных случаях решение задачи разделения многокомпонентной смеси возможно либо в нормально-фазовом, либо в обращенно-фазовом режимах. Нормально-фазовый режиме хорошо зарекомендовал себя в случае разделения соединений с различными функциональными группами; в обращенно-фазовом – хорошо разделяются гомологи. Если при изократическом элюировании не удается достичь требуемой селективности разделения, используют градиентный режим. Элюирующая сила подвижной фазы может быть изменена варьированием рН или добавлением ион-парных агентов. Проведением дериватизации (введением в разделяемые компоненты хромофорных или электрофорных групп) изменяют хроматографические характеристики аналитов, уменьшая время анализа и снижая предел их обнаружения. Выбор подвижной фазы в жидкостной хроматографии является важным фактором. Наиболее существенной ее характеристикой является полярность. В принципе сначала выбирают неподвижную фазу, имеющую полярность, близкую к разделяемым компонентам, а уж затем подбирают элюент так, чтобы значения факторов емкости оказались в интервале от 2 до 5. Если полярность подвижной фазы близка полярности неподвижной, времена удерживания аналитов будут слишком малы для их полного разделения; если же полярности подвижной и неподвижной фаз различаются существенно, времена удерживания окажутся очень большими, т.е. заметно возрастет общее время анализа. В жидкостной хроматографии необходимо соблюдение требования растворимости образца в подвижной фазе, что, в свою очередь, определяется балансом гидрофильность/гидрофобность. Существует два вида элюирования: изократическое и градиентное. При изократическом – состав элюента не меняется. При градиентном элюировании состав элюента меняется по определенной программе. В последнем случае достигается лучшее разделение. Градиентный анализ позволяет осуществить разделение веществ различной полярности более эффективно.
