Аффинная хроматография
Особое место в жидкостной хроматографии занимает аффинная (affinity – сродство), или биоспецифическая хроматография – наиболее распространенный метод выделения и очистки биологически активных веществ, предназначенных для целей молекулярной биологии и медицины. Их исследование имеет принципиальное значение для контроля оптической чистоты производимых лекарственных средств.
Научные основы метода заложены в 1951 г. в США, хотя первые экспериментальные указания на большие потенциальные возможности аффинной хроматографии (АХ) были получены еще в 1910 г. Штаркенштейном, использовавшим крахмал для выделения амилазы.
Метод основан на уникальной способности биологически активных соединений к молекулярному распознаванию и образованию специфических и обратимо диссоциирующих комплексов с комплементарными адсорбционными центрами, иммобилизованными на поверхности стационарной фазы. Фермент узнает свой субстрат, антиген – антитело, гормон – рецептор.
Процесс разделения веществ с использованием АХ включает несколько самостоятельных этапов:
- выбор матрицы для АХ и ее активация;
- иммобилизация на поверхности активированной матрицы биологически активных соединений, называемых аффинными лигандами, или аффиантами, в качестве которых могут быть белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, витамины, аминокислоты и т.д.;
- хроматографический анализ, в процессе которого и происходит специфическое и обратимое комплексообразование аффианта со строго определенным биологически активным соединением;
- и, наконец, разрушение образовавшегося комплекса и элюирование специфически адсорбированного вещества.
Матрицы для сорбента в аффинной хроматографии
Идеальная матрица, применяемая для иммобилизации биологически активных веществ, должна обладать высокой механической прочностью и проницаемостью; большой удельной поверхностью и нерастворимостью в подвижных фазах; высокой гидрофильностью и биосовместимостью; химической реакционной способностью, позволяющей легко вводить в качестве лигандов различные биомолекулы; обеспечивать легкость получения производных при комнатной температуре в водной среде.
Типичные матрицы для АХ
Агароза (структурная единица – D-галактоза), характеризуется высокой жесткостью, обеспечивающей стабильность скорости потока подвижной фазы, обладает достаточной пористостью, что необходимо при удерживании белковых молекул с молекулярными массами до нескольких миллионов.
Супероза (для ВЭЖХ) – агарозный гель; характеризуется высокой степенью сшивки и низкой неспецифической адсорбцией. Используется в сочетании с водными средами в диапазоне рН 3 – 14. Совместима также с такими подвижными фазами, как этиленгликоль, этанол. Тетрагидрофуран, ацетон, хлористый метилен.
Целлюлоза – высокопористая матрица со сферическими гранулами. Превосходит по реакционной способности другие полимеры.
Декстраны – полисахариды, состоящие из a-1,6-глюкозы, сшитые эжпихлоргидрином . Коммерческий продукт – Сефадекс.
Полиакриламид (биогель Р) – биологически инертен и не подвержен микробной актаке. Рабочий диапазон рН 1 – 10.
Трисакрил – высоко гидрофильный материал; три гидроксиметильные группы в его молекуле и одна алкиламидная обеспечивают высокую гидрофильность. Используется при разделении биологичнеских макромолекул – белков, клеток. Он стабилен при низких и высоких температурах, а также при низких значениях рН; меньшая стабильность при высоких рН объясняется медленным гидролизом амидных связей.
Полиакриламид-агарозные гели (Ультрагели) обладают жесткой структурой, мало подвержены действию давления, поэтому могут обеспечивать высокие скорости потока подвижной фазы.
